紫外可見分光光度計的原理是利用物質(zhì)的分子或離子對某一波長范圍的光的吸收作用，對物質(zhì)進行定性分析，定量分析及結(jié)構(gòu)分析，所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中的特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜。根據(jù)所吸收光的波長區(qū)不同，分為紫外分光光度法和可見光光度法，合稱為紫外可見分光光度法。

      紫外可見分光光度法是研究物質(zhì)在紫外可見光波下的分子吸收光譜的分析方法，在光的性質(zhì)中200-400nm波長的光叫做紫外（UV），從400-800nm叫做可見（VIS），從800nm到近1毫米是紅外（IR）。僅可見光才能被我們的眼睛看見，而包含所有波長的光，包括紫外，可見光和紅外叫做白光（例如太陽光），太陽光發(fā)出的白光可以通過棱鏡濾光片等分成七種類似彩虹的顏色，白光即包含所有波長的光，單色光即單波長的光。

      根據(jù)朗伯比爾定律：A＝kbc表明：一定溫度下，一定波長的單色光通過均勻的、非散射的溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。

      A＝kbc式中:

      A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

      k：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol－１·cm－１；

      b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

      c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

      我們可以舉個小例子來說明一下，有甲乙兩個相同材質(zhì)的玻璃杯，其中甲裝有潔凈的水而乙裝的是渾濁的水把它們放在靠窗的地方，這時甲可以透過大部分的光，而乙則沒有那么多光透過，在這里透過的光的比率稱為透射比，透射比通常以百分比形式來表示（%T）相反的從窗口透過的的光被吸收比率*叫做吸收率（Abs）。

      物質(zhì)對光的吸收是選擇性的，利用被測物質(zhì)對某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，通過測定被測物質(zhì)對不同光的吸收強度，以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標即可得出該物質(zhì)在測定波長范圍的吸收曲線。在吸收曲線中，通常選用*大吸收波長進行物質(zhì)含量的測定。例如蘋果是紅色的，為什么蘋果看上去是紅色的而不是別的顏色？*好比我們對某種顏色喜歡一樣，物質(zhì)對顏色也有偏好，當某種物質(zhì)暴漏包含各種顏色的光中時，它吸收并僅保存了光中它*喜歡的顏色，它不喜歡的顏色被反射，這*形成了我們眼中看到的某種物質(zhì)的顏色。

      根據(jù)這一特性我們即可通過顏色密度來對物質(zhì)進行定量分析以此來測定某種物質(zhì)（溶液）的含量，例如我想測自來水里的鐵，通常無法直接采用分光光度法進行測量，因此在這種方式測定中需要添加與目標物質(zhì)反應顯色的著色試劑，里面含鐵越多則顏色*越深（高吸光度）少則相反。這時我們需要配置標準溶液的校正曲線，從低到高來測量標準濃度的吸光值獲得該測量的校正曲線。在定量分析中還要考慮物質(zhì)的吸收波長，通過觀察測量已經(jīng)著色的吸收光譜來選擇吸收*大而相對平滑的波長（現(xiàn)在多數(shù)儀器已能自動測量物質(zhì)的*佳吸光率如HACH的DR3900）。

      實際測量時光譜與測定條件也有密切的關(guān)系，測定條件如溫度，溶劑極性等不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強度等都可能發(fā)生變化。對于溶劑的選擇要注意盡量選用低極性溶劑同時能很好的溶解被測物，并形成溶液具有良好的化學性質(zhì)和光化學的穩(wěn)定性，溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯的吸收并注意保證實踐條件的一致性，這樣既能保證*小誤差又可達到*佳的測量結(jié)果。

紫外可見分光光度計的機理：

      盡管我們可以通過感知物質(zhì)的顏色來預測總的吸收波長，但無法進行*的波長分析，而且還可能存在著個體差異，另外人眼也無法觀測到紫外線區(qū)。而在紫外可見分光光度計的系統(tǒng)中不存在個體的差異，原因是在分光光度計中使用人造光源來代替白光，光不是直接照射在物體上的，而是通過棱鏡或衍射光柵將白光分成許多顏色，然后每種顏色（單色光）分別掃描物體來測量物質(zhì)的吸收波長。

紫外可見分光光度計的基本構(gòu)造：

      分光光度計主要由光源、單色器（分光鏡）、吸收池、檢測器和顯示器五大部分組成。

      光源：在整個紫外光區(qū)或可見光區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命，可見光區(qū)常用的光源是鎢燈或碘鎢燈，波長范圍是350-1000nm。在紫外區(qū)常為氫燈或氘燈，發(fā)射的連續(xù)波長范圍是180-360nm。

      單色器：是將光源輻射的復合光分成單色光的光學裝置。它是分光光度計的心臟部分。單色器一般由狹縫、色散元件及透鏡系統(tǒng)組成。關(guān)鍵是色散元件，*常見的色散元件是棱鏡和光柵。

      ?狹縫：將單色器的散射光切割成單色光。直接關(guān)系到儀器的分辨率。狹縫越小，光的單色性越好。分為入射狹縫和出射狹縫。

      ?棱鏡：175-2700nm的光能被分開，色散隨波長變化，波長長色散差，材質(zhì)主要有水晶和溶凝石英。

      ?光柵：色散在整個波長范圍內(nèi)是統(tǒng)一的。1個衍射光柵能獲得寬波長。另外，用常量狹縫寬度能獲得常量光譜。因此具有波長范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便的優(yōu)點。

      樣品池：用于盛裝試液的裝置。吸收材料必須能夠透過所測光譜范圍的光。一般可見光區(qū)使用玻璃吸收池，紫外光區(qū)使用較貴的石英吸收池。測量時要挑選配對，因為吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程長度的精度等參數(shù)對分析結(jié)果都有影響。

      檢測器：用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電管、光電倍增管、光電二極管、光電攝像管等。它的作用是充當在紫外和可見區(qū)有靈敏性的光電管和放大器的作用。要求靈敏度高、響應時間短、噪聲水平低、穩(wěn)定性好等性質(zhì)。

      顯示器：將檢測到的信號輸出顯示出來，能直觀的對結(jié)果進行觀看分析。

分光光度計的分類：

      一般有可見分光光度計，紫外分光光度計，可見紫外分光光度計，紅外分光光度計等。按儀器使用的光學系統(tǒng)還分為單光束、雙光束、多波長光度計等。

單光束：經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進行吸光度的測定。這種光度計的特點是簡單便宜適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。

      雙光束：經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強度相等的兩束光，一束通過參比池，一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。一般具備快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。此種儀器操作復雜價格較高。

      雙波長：由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束不同波長的單色光；通過折波器以一定的頻率交替通過同一樣品池，然后由檢測器交替接收信號，*后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值從而扣除了背景吸收的吸光度，達到更*的測量效果。